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細胞培養常見問題及其解決方法
細胞培養常見問題及其解決方法
合肥博美生物科技有限責任公司 / 2015-03-02
細胞培養常見問題及其解決方法
9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。
10.冷凍管應如何解凍?
取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時, 必須注意安全, 預防冷凍管之爆裂。
11. 細胞冷凍管解凍培養時, 是否應馬上去除DMSO?
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外, 絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞), 在解凍之后, 應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。
12. 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。
13.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?
欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。
14. 細胞冷凍培養基之成份為何?
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。
15.DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?
冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
16.冷凍保存細胞之方法?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。
17. 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
18.培養基中是否須添加抗生素?
除于特殊篩選系統中外, 一般正常培養狀態下, 培養基中不應添加任何抗生素。
19.應如何避免細胞污染?
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。
20.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?
原則上:直接滅菌后丟棄之。
當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1.在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2.分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3.每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。
4.確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2~3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2~3代。
5.在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6.重復步驟4。
7.在無抗生素的培養基中培養4~6代,確定污染是否以已被消除。
21.支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?
不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株, 無法以其外觀分辨之。
22.支原體污染會對細胞培養有何影響?
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數, 代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。
23. 偵測出細胞株有支原體污染時, 該如何處理?
直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。
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44. 培養基中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?
一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時,您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。
45.培養基及其它添加物和試劑可反復凍融嗎?
大部分添加物和試劑最多可以凍融3次,如果次數更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會影響它的性能。
46.為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?
胰蛋白酶在4℃就可能開始降解,如果在室溫下放置超過30分鐘,就會變得不穩定。
47.保存血清最好的方法?
我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時,請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶,建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內,再放回冷凍。
48. 如何解凍血清才不會使產品質量受損?
將血清從冷凍箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室溫下使之全融。但必須注意的是,融解過程中必須規則地搖晃均勻。
49. 血清解凍后發現有絮狀沉淀物出現,該如何處理?
血清中沉淀物的出現有許多種原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,也會存在于血清中,亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物,并不影響血清本身的質量。
若欲去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝至無菌離心管內,以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物,因為它可能會阻塞過濾膜。
50. 為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學研究,培養ES細胞、平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。
51. 有必要做熱滅活嗎?
實驗顯示,經過正確處理的熱滅活血清,對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或完全沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量,而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,像是“小黑點”,常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染,而把血清放在37℃環境中,又會使此沉淀物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。
若非必須,可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間,更確保血清的質量!
52. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀?
有些胎牛血清產品沒有預老化,儲存在2-8℃時,血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在-20℃儲存胎牛血清,避免反復凍融。
53. 如何避免沉淀物的產生?
我們建議您在使用血清的時候,注意下列的操作:
(1)解凍血清時,請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫),若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃),非常容易產生沉淀物。
(2)解凍血清時,請隨時將之搖晃均勻,使溫度及成分均一,減少沉淀的發生。
(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久,血清會變得混濁,同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害,而影響血清的質量。
(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以無須做此步驟。
(5)若必須做血清的熱滅活,請遵守56℃,30分鐘的原則,并且隨時搖晃均勻。溫度過高,時間過久或搖晃不均勻,都會造成沉淀物的增多。
細胞培養常見問題解答(FAQ)
9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于–20 °C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機會。
10 懸浮性細胞應如何繼代處理?
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中, 稀釋細胞濃度即可, 若培養液太多時, 可將培養角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶, 加入新鮮培養基稀釋至適當濃度, 重復前述步驟即可。
11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?
欲回收動物細胞, 其離心速率一般為300xg (約1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉速, 將造成細胞死亡。
12 細胞之接種密度為何?
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。
13 細胞冷凍培養基之成份為何?
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細胞液中, 必須使用前先行配制完成。
14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?
冷凍保存使用之DMSO 等級, 必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質, 并可減少污染之機會。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。
15 冷凍保存細胞之方法?
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時, 以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微
降低一些。
16 細胞欲冷凍保存時, 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
17 應如何避免細胞污染?
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。
18 如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?
直接滅菌后丟棄之。
細胞培養常見問題及解答
4.GlutaMAX-I是什么?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?
GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,將其不穩定的α-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。
5.為什么培養基中可以省去加酚紅?
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。
6.如何用臺盼蘭計數活細胞?
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200-2000個/毫升,在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞?;罴毎懦馀_盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。
7.如何消除組織培養的污染?
當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2)分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3)每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。
4)確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2-3代。
5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6)重復步驟4。
7)在無抗生素的培養基中培養4-6代,確定污染是否以已被消除。
9.Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什么?Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。
10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序,而且除了這些標準檢測,Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測:
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗
生物化學檢測
激素的檢測
血紅蛋白檢測
Sf9 細胞生長促進及方法學檢測
11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。
12.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎?
是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中,稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中?;旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后,在復合物中加入含有血清的培養基(800μl)。(注意以上是35mm培養皿使用體積)。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體,接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。
13.我使用SF900 Ⅱ時,細胞生長良好,但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好?
如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。
14.如何檢測內毒素(熱源)水平?
LAL(Limulus Amebocyte Lysate)試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟(Limulus polyphemus)血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統(絲氨酸蛋白酶級聯反應系統),通過修飾凝集素,產生一種透明的膠,LAL中的凝固蛋白,從而,形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟(血細胞)裂解物。
胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island,按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前,用無熱源的水1:10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘,以消除抑制劑。(通常,血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程,使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。)
15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎?
如果使用固體形式的培養基,需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌,應該高壓滅菌瓊脂溶液,然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。
16. 20℃下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎?
對于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。
下表列出溫度改變10℃時,PH值的變化情況
例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-(2x0.310)=6.78
17. 室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少?
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同的PH值。
19. High Five細胞有任何其它名稱嗎?
High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
20.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少?
High Five無血清培養基中去污劑的濃度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。
21.High Five細胞用多大的密度凍存?
3.0x10E6 cells/ml
22.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎?
可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。
24.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少?
為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。
26.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎?
通常情況當細胞經過30次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候記數時,都應該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。